De la estructura y la mecánica in vivo de las células ostiolares y la válvula aórtica del corazón de la larva de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes microscópicas de alta resolución.
AUTORES: CLAUDIA RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ y JUAN SÁNCHEZ MATEOS.
Alumnos de 3º y 4º de ESO
COORDINADOR: JESÚS MANJÓN SÁNCHEZ, Profesor de Biología y Geología jesusmanjon60@gmail.com
IES MAESTRO GONZALO KORREAS. Avda. Torremenga, 2 10400 Jaraíz (Cáceres)
NOTA: Haciendo click sobre las imágenes podrás verlas a tamaño original.
RESUMEN: Drosophila melanogaster es uno de los modelos de invertebrados más empleados en investigación que posee un corazón tubular con un total de 3 pares de válvulas ostiolares (incurrentes) y una válvula aórtica (excurrente). Poco se conoce de su mecánica de bombeo. Esta investigación muestra los hallazgos realizados mediante la grabación en video HD de la actividad de las células del corazón de larvas vivas de D. melanogaster. A gran aumento (400-1000X) se muestran en acción los diversos tipos celulares: cardiomiocitos, células de los ostiolos, válvula aórtica y músculos alares. Demostramos que cada ostiolo está flanqueado por dos células que lo cierran posiblemente de un modo activo cuando se contraen durante la sístole. Con una resolución temporal de 40 ms analizamos la mecánica del corazón de larvas de Drosophila y demostramos que hay apertura/cierre simultáneos de los tres pares de ostiolos –igual que en el embrión- a pesar de que se daba por sentado que una onda de contracción sistólica recorre el corazón de la larva de atrás hacia delante. Nuestro trabajo demuestra que el corazón de las larvas se contrae y dilata todo a la vez.
- INTRODUCCIÓN.
Dos cursos atrás, estando en Primer Ciclo de ESO, tuvimos nuestro primer contacto con el mundo de la investigación científica. La investigación que llevamos a cabo entonces consistió en el análisis del latido cardiaco in vivo de embriones del pez cebra (Danio rerio) y larvas y pupas de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) que nosotros mismos criamos en nuestro centro. Dos principios guiaron este nuestro primer trabajo científico:
- La observación de la actividad vital de las primeras fases del desarrollo de estos organismos mediante técnicas no invasivas y sin procurarles daño alguno, aprovechando su transparencia y su accesibilidad para ser observados in toto al microscopio.
- El empleo de las modernas técnicas de tratamiento digital de imágenes científicas que nos permitían un análisis cuantitativo fino y extraer conclusiones basadas en la elevada resolución espacial y temporal de las imágenes de vídeo HD capturadas mediante cámaras compactas a través del ocular del microscopio.
A comienzos del curso pasado, en una de las sesiones de trabajo iniciales nos encontramos con el corazón de la larva como nunca lo habíamos captado. Impactados por la visión y con el reto de trabajar a nivel celular, a gran aumento, queríamos ver cómo trabajan las células del corazón de este pequeño animal. Recordamos un artículo sobre la mecánica del corazón del embrión de Drosophila (Wu, M, Sato TN 2008) y nos pusimos a trabajar. Este es el resultado.
- ANTECEDENTES
Drosophila melanogaster es uno de los modelos de invertebrados más empleados en investigación de la fisiología normal y patológica del corazón humano (Choma MA, et al. 2011) Su homología con el corazón humano ha sido establecida en diferentes trabajos (Fink M, et al.2009). La larva posee un vaso dorsal tubular que se extiende desde el octavo segmento abdominal hasta la cabeza donde se abre a la cavidad general del cuerpo, como sistema circulatorio abierto de baja presión (Robstein B & Paululat A y 2016 y Snodgrass R E 1935 ).
En la larva de Drosophila, como en el embrión, el tubo del corazón está formado por dos hileras opuestas de 52 cardiomiocitos que forman el tubo del corazón. Músculos alares, nefrocitos (células pericárdicas) y armazón de tejido conectivo forman parte de estructuras accesorias. Cada uno de los tres pares de ostiolos está flanqueado por un par de células ostiolares (Wu, M, Sato TN 2008 y Robstein B & Paululat A y 2016). La única válvula intracardiaca es la aórtica constituida por dos voluminosas células. Sin embargo, poco se conoce de su mecánica de bombeo y de la actividad de sus células ostiolares y mucho se da por supuesto. El corazón de larvas y adultos es alargado y tubular y aun no se conoce bien su mecánica precisa. Además, la biomecánica de las células ostiolares y de la válvula aórtica no ha sido profusamente tratada en la literatura científica, reflejando cierto grado de desconocimiento del binomio estructura-función in vivo. No hemos encontrado descripciones carentes de ambigüedad ni de su estructura ni, mucho menos, de su actividad durante el ciclo cardiaco. En el citado artículo (Robstein B & Paululat A y 2016 p5 2016) se describe sucintamente la actividad de las células ostiolares del siguiente modo: “Actúan pasivamente como un válvula de dos hojas”.
- HIPÓTESIS DE TRABAJO
Nos planteamos, pues, dos objetivos: obtener un registro en vídeo digital de la estructura y la actividad in vivo del corazón y verificar la validez de tres hipótesis estrechamente relacionadas:
- Los tres pares de válvulas ostiolares están formadas por pares de células que pasivamente abren/cierran el ostiolo haciendo bisagra con los cardiomiocitos que las flanquean.
- A pesar de su longitud, el corazón propio se contrae/dilata todo a la vez tal y como ocurre en el embrión.
- Existe sólo una válvula intracardiaca funcional en larvas de 2º y 3er instar: la válvula aórtica formada por dos voluminosas células que pasivamente ocluyen el paso a la aorta.
- MATERIALES Y MÉTODOS
Varios cultivos fueron iniciados a partir de individuos hembra de tipo salvaje de Drosophila melanogaster atraídos y que depositaron sus huevos en recipientes con la papilla nutricia. En diciembre y enero la temperatura de los cultivos en el laboratorio era de 18 ºC +- 1ºC. A esta temperatura su frecuencia cardiaca es más lenta y nos permite un seguimiento más fácil con cámaras DSLR convencionales acopladas al ocular. Siempre grabamos en formato Full HD a 25 fps. Utilizamos larvas de segundo y tercer instar para realizar los registros de su actividad cardíaca in vivo. Inmovilizamos las larvas colocándolas en agua entre el porta y el cubre, según la técnica descrita en Nienhaus U, Aegenter-Wilmsen T, Aegenter CM 2012. Aquí analizamos una selección-muestra de 34 clips en formato AVI de unos 20 s de duración cada uno procedentes de ese de ese material original. El procesado digital y análisis de imágenes científicas se ha realizado con Fiji y ha consistido en: realzado de imágenes, calibrado, anotación, extracción de secuencias y elaboración de diagramas M-mode (Fink M, et al. 2009),
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Células ostiolares
Fig. 1. Montaje con el aspecto del corazón en sístole (izda.) y diástole (dcha.) de una larva de tercer instar –clip 4E_2247. Se extiende desde el segmento VIII abdominal hasta el V donde comienza la aorta. La flecha verde indica la dirección del flujo de hemolinfa. Las flechas amarillas indican la posición de los ostiolos y la válvula aórtica. Se aprecian las voluminosas células pericárdicas (nefrocitos sin función mecánica). Vemos que todo el corazón se dilata a la vez en toda su longitud para su llenado, doblando casi su diámetro. Un cálculo aproximado, considerando el corazón como un cilindro, arrojó un gasto diario de casi 1 ml.
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Figura 2. El ostiolo II captado frontalmente a 1000X en el clip 4E_1263 en un montaje que lo muestra cerrado (superior) y abierto (inferior). Las células ostiolares flanquean la abertura en forma de ojo y recuerdan a los párpados en su forma y ocupan toda la dimensión lateral del corazón. Núcleos voluminosos con nucléolos patentes en el centro y 
próximos al borde libre. La estriación es patente y el borde grueso e indentado parece contribuir al cierre hermético.
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Figura 3. El ostiolo II captado frontalmente in vivo a 1000X en el clip 4E_1263. Se muestran dos secuencias de 4 fotogramas a intervalos de 40 ms. En la secuencia vertical de la izquierda se puede ver el primer contacto entre las células ya al final de la diástole. Las flechitas amarillas señalan la pared del corazón. Esta apenas se ha movido, en lo que se conoce como diastasis diastólica, y sin embargo las dos células ostiolares ya se han juntado. Además, esto ocurre a una velocidad vertiginosa: en apenas 40 ms pasa de estar totalmente abierto a cerrarse. En la secuencia vertical de la derecha ocurre lo contrario al final de la sístole: aún contraído el corazón –la pared señalada en la secuencia apenas se mueve- y ya en el segundo fotograma las células comienzan a separase. Es posible que por una brusca relajación.
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5.2 Válvula aórtica
Figura 4. Diagrama M-mode del comportamiento de la válvula aórtica obtenido según dos líneas perpendiculares que atraviesan las células de la válvula. Resulta al menos sorprendente que haya contracción-expansión simultánea en ambas dimensiones. Se podría interpretar esto como prueba de su contractibilidad y un comportamiento no tan pasivo como se suponía.
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5.3 Mecánica del corazón propio
Figura 5. Montaje obtenido del clip 6E_2296, mostrando la foto superior al corazón sistólico contraído con válvulas cerradas y la foto inferior el corazón en diástole, dilatado, con los ostiolos abiertos –V encima de la flechitas rojas. A pesar de ser tubular y bastante más largo que en el embrión, el corazón de la larva se contrae-dilata todo a la vez a la par que los ostiolos cierran-abren simultáneamente. En todos los casos registrados y analizados el comportamiento es similar.
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Figura 6. Montaje con los diagramas M-mode obtenidos en los 3 puntos indicados (1,2 y 3) con líneas amarillas en la figura anterior. Su examen pone de manifiesto la gran sincronización de actividad en toda su longitud y el cierre-apertura simultáneos de los tres pares de ostiolos y la apertura-cierre de la válvula aórtica. El visionado de los clips de los 14 individuos de la muestra de larvas de Drosophila sometidos a nuestro estudio deja casi sin lugar a dudas que el corazón, a pesar de ser tubular y bastante más largo que en el embrión, se contrae-dilata todo a la vez y que los ostiolos cierran-abren simultáneamente.
6. CONCLUSIONES
Llegados a este punto de nuestra exposición, hacemos explicitas nuestras conclusiones respecto a la validez o no de nuestras hipótesis de trabajo enunciadas en el apartado 3 de este resumen.
- La afirmación de que los tres pares de válvulas ostiolares están formadas por pares de células que pasivamente abren/cierran el ostiolo no se sostiene. Humildemente creemos que aportamos evidencia suficiente como para dudar de la validez de esa suposición. Pensamos además, que ese carácter contráctil que sospechamos poseen es coherente con la naturaleza celular de las válvulas ostiolares.
- La hipótesis de que a pesar de su longitud, el corazón propio se contrae/dilata todo a la vez tal y como ocurre en el embrión se ve reforzada en su validez con nuestras aportaciones evidenciadas más arriba.
- Confirmamos que existe sólo una válvula intracardiaca funcional en larvas de 2º y 3er instar: la válvula aórtica formada por dos voluminosas células que pasivamente ocluyen el paso a la aorta. No obstante, algunos de nuestros resultados ponen en entredicho ese carácter pasivo.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos especialmente a nuestros profesores de Biología D. José Estévez García, colaborador necesario y valiosísimo, y D. Jesús Manjón Sánchez, coordinador de este trabajo, la atención constante que nos muestran. A los compañeros de nuestro equipo, a nuestras familias por su incondicional apoyo, a la Consejería de Educación del Gobierno de Extremadura y a los responsables del IES Maestro Gonzalo Korreas que nos han permitido utilizar sus instalaciones.
BIBLIOGRAFÍA
- Choma MA, et al. (2011) Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertébrate cardiovascular system. Model. Mech. May: 4(3): 411-420. Published online 2010 December 23 doi:10.1242/dmm.005231
- Cooper, A S, et al.(2009) Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies. Vis. Exp. (33), e1596, doi: 10.3791/1596.
- Fink M, et al.(2009) A new method for detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish, and embryonic mouse hearts. Bio Techniques 46:101-113 (February 2009) doi 10.214/000113078.
- Nienhaus U, Aegenter-Wilmsen T, Aegenter CM (2012) In-vivo imaging of the Drosophila Wing Imaginal Disc over Time: Novel Insights on Growth and Boundary Formation
- Robstein B & Paululat A (2016) On the Morphology of the Drosophila Heart. Cardiovasc.Dev.Dis. 2016, 3, 15; doi:10.3390/jcdd3020015
- Snodgrass R E (1935) Principles of Insect Morphology. McGraw-Hill Book Company, Ltd. 232425-MAMM-798. 50510
- Wu, M, Sato TN (2008) On the Mechanics of Cardiac Function of Drosophila Embryo. PloS ONE 3(12):e-4045. Doi:10.371/jpournal-pone.0004045
- Fiji is Just ImageJ (http://fiji.sc/Fiji)
